Média e distribuição do tamanho colonial de cepas de Streptococcus sanguinis e taxas de invasão

Para isso, as cepas de Streptococcus sanguinis foram cultivadas sob condições padronizadas de meio de cultura, tempo e temperatura de incubação. Para garantir a reprodutibilidade e a confiabilidade estatística, todos os ensaios microbiológicos e de infecção foram realizados em três experimentos independentes (triplicatas biológicas). Após o período de incubação, as placas de cultura contendo as colônias isoladas foram digitalizadas/fotografadas em alta resolução junto a uma escala física para calibração.

No software de processamento de imagem ImageJ, o sistema foi calibrado e foram realizadas as medições individuais do tamanho (diâmetro em mm) de todas as colônias correspondentes a cada cepa em cada um dos três experimentos. A partir dos dados brutos, calculou-se a média e o desvio padrão (DP) do tamanho colonial de cada cepa. Adicionalmente, as colônias foram categorizadas por faixas de tamanho para o cálculo da frequência relativa (%) de colônias pequenas, médias e grandes geradas por cada isolado.

Para avaliar a taxa de invasão bacteriana, as cepas de S. sanguinis foram submetidas a ensaios de invasão utilizando células HUVEC. Paralelamente, como grupo de controle/comparação, as bactérias foram tratadas apenas com soro humano. Após o período de persistência intracelular e eliminação das bactérias extracelulares (via protocolo de proteção por antibiótico), as células foram lisadas para recuperação das bactérias intracelulares .

Alíquotas do lisado foram semeadas em ágar para contagem de colônias (UFC). A taxa de invasividade foi determinada comparando-se a porcentagem de colônias recuperadas após o ensaio de invasão em HUVEC com a porcentagem daquelas recuperadas no grupo tratado apenas com soro humano.